消化液常在貼附型細胞原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)過程中用來分散組織或細胞團，以達到離散細胞，獲得細胞懸液的目的。目前常用的消化液主要有胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液以及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA—2Na)液。其中，胰蛋白酶溶液是使用范圍zui廣的消化液；EDTA—2Na由于消化能力較弱，常與胰蛋白酶混合使用；膠原酶則多用于原代培養(yǎng)中將特殊組織的細胞與膠原成分的分離。一般來說，這些消化液可以單獨使用，也可以按一定比例混合使用，這主要取決于處理細胞類型的不同。
1)胰蛋白酶液
胰蛋白酶(Trypsin)是一種黃白色粉末，來自?；蜇i的胰臟。當其水解蛋白質時，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白質的能力來表示，常用的有1：125和1：250兩種，即1份胰蛋白酶能解離125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織使用。胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和細胞的性質密切關。不同的細胞對胰蛋白酶液的濃度、溫度和作用時間等要求也不一樣。一般來說，濃度越大、溫度越高、作用時間越長，對細胞的分離能力也越大，但超過一定限度就會損傷細胞。常用的胰蛋白酶液的濃度是O.25％和0．125％，作用溫度是37℃或室溫，pH 7．4左右：許多學者認為Ca 2+ 、Mg 2+和血清的存在都會降低胰蛋白酶的活力。為使胰蛋白酶達到松弛細胞間連接和深入至單層細胞基底面及外側面，細胞在進行胰蛋白酶液處理前，先用無Ca 2+、Mg 2+的D-Hank’s液洗滌，去除培養(yǎng)液剩留的血清、鈣及鎂離子；再用D—Hank’s液配制的胰蛋白酶液消化細胞，細胞一旦分散，即用血清培養(yǎng)液終止胰蛋白酶對細胞的繼續(xù)消化作用
胰蛋白酶液的配制方法如下：
①按實驗需要稱取酶粉，用少量D—Hank’s液將胰蛋白酶粉調成糊狀。
②加適量D．Hank's液(橙紅色)，低速磁力攪拌(室溫和4℃間斷進行，室溫高于30℃時要減少酶液在室溫中的攪拌時間)至酶液溶解。
③溶解后的酶液(深紅色)，濾過除菌，小瓶分裝，一20℃凍存。
2)二乙胺四乙酸二鈉液
EDTA—2Na是一種化學鰲合劑(商品名為Vorson)，它對傳代細胞有一定的解離作用，并且毒性小，使用方便。常用D．Hank’s液配成O．02％EDTA工作液，經(jīng)高壓滅菌后使用。EDTA的作用原理為：一些組織細胞，尤其是上皮組織細胞，在生長過程中需Ca 2+和Mg 2+ 參與細胞間連接，維持組織的完整性，EDTA從細胞生存環(huán)境中奪取Ca 2+和Mg 2+ ，并與這些離子形成螯合物，從而使細胞分離。因此，胰蛋白酶和EDTA混合使用可提高消化效率。EDTA不可與膠原酶聯(lián)用．因為膠原酶的消化作用依賴于Ca2+。EDTA可損傷線粒體，它與核蛋白中的鈣、鎂離子結合，破壞核蛋白結構。細胞長期處于無鈣環(huán)境，鉀離子濃度降低，細胞呼吸減弱。EDTA作用不受血清抑制，故消化后需*漂洗，否則會影響細胞生長。
3)膠原酶液
膠原是細胞間質的主要成分，天然三股螺旋構象的膠原在生理溫度和pH下，不能被其他任何蛋白酶水解，而只能被膠原酶(collagenase)降解。膠原降解后，可進一步被其他蛋白酶降解。目前從不同組織分離的膠原酶有20多種，作用于天然膠原分子的N端1／4處，水解甘氨酸一異亮氨酸或甘氨酸一亮氨酸之間的肽鍵。不同批號或同一批號不同日期的膠原酶，其質量都有差異。目前國內多數(shù)實驗室使用的膠原酶，大多是從芽孢桿菌中提取出來的。溶組織梭狀芽孢桿菌膠原酶中含梭茵肽酶(0．57～0．59 μg／mg)，具有較強的細胞毒性，能破壞細胞膜上的蛋白多肽，從而改變細胞膜的通透性，因此用它消化組織時，應采取多步收集法(20．30 min／次)，這樣才可獲得完整細胞膜和zui大活細胞收率。膠原酶在Ca 2+和Mg 2+存在下仍有活性，血清亦不能抑制其活性，故消化后應充分漂洗。不同來源的膠原酶對于不同類型的膠原的作用強弱不等。
膠原酶液的配制方法如下：膠原酶用基礎營養(yǎng)液配制。常用劑量為200 μg/mL或0.1～0.3 mg/mL。膠原酶粉用基礎營養(yǎng)液調成糊狀，液體加至定量后，磁場攪拌至基本溶解。濾過除菌，按1次用量分裝，一20℃凍存。
此外還有鏈霉蛋白酶(pronase，酶活性不能被血清終止，適合消化道黏膜細胞、kupter細胞等分離)、透明質酸酶(hyaluronidase，作用細胞外基質透明質酸)、DNA酶(deoxyribonuclease，作用破碎細胞釋放的DNA，酶活性可被Mg 2+和Ca 2+活化)、中性蛋白酶(dispase，用于上皮細胞分離)等。這些酶價格昂貴．只在獲取某類特殊細胞的情況下使用。由于酶作用的特異性，單一酶水解蛋白的能力有限。采用混合酶作消化劑，如利用DNA酶和胰蛋白酶分離小鼠胚胎成纖維細胞，利用膠原酶、透明質酸酶、胰蛋白酶分離大鼠心室細胞，效果會更好。
在線客服
